28 ژنوتیپ از گونه M. spicata و 6 ژنوتیپ از گونه M. piperita بودند.
3-4- نحوه اجرای آزمایش در مزرعه
نمونههای ریزوم ژنوتیپهای مربوط به گونههای مختلف به مزرعه چاه اناری دانشگاه صنعتی اصفهان انتقال داده شده و طی سال اول مطالعه، در کرتهای 1×1 متر مربع در قالب طرح بلوکهای کامل تصادفی در 2 تکرار کشت گردیدند. اولین آبیاری بلافاصله پس از کاشت صورت گرفت و آبیاریهای بعدی در صورت نیاز و هفتهای 2 تا 3 بار انجام شد. کنترل علفهای هرز در سال اول به روش دستی و همچنین با استفاده از سم گراماکسون 2 در هزار (با کاربرد مستقیم روی علفهای هرز بین ردیفها) و در سال دوم تنها با روش دستی انجام شد. گیاهان در سال اول و دوم در مرحله 75 درصد گلدهی برداشت شده و صفات مورفولوژیک و فیزیولوژیک آنها اندازهگیری و یادداشت برداری شد.
3-5- اندازهگیری صفات زراعی و مورفولوژیک
در هر دو سال آزمایش، اندازهگیری صفات مورفولوژیک بر روی 10 بوته در هر کرت انجام شد. این صفات عبارت بودند از:
1- ارتفاع گیاه: فاصله بین طوقه تا ابتدای سنبله در زمان گلدهی بر حسب سانتیمتر
2- تعداد ساقه فرعی: تعداد ساقههای فرعی تولید شده بر روی ساقه اصلی
3- طول سنبله ساقه اصلی: فاصله ابتدا و انتهای طول سنبله در ساقه اصلی بر حسب سانتیمتر
4- تعداد سنبله در گیاه: شمارش تعداد سنبله موجود بر روی ساقه اصلی و ساقههای فرعی
5- طول برگ: فاصله بین ابتدا و انتهای طول برگ
6- عرض برگ: فاصله بین ابتدا و انتهای عرض برگ در قسمت میانی برگ
7- سطح برگ: تعیین مساحت 50 برگ گیاه با استفاده از دستگاه سطح برگسنج
8- محتوای آب اندام هوایی: در هر ژنوتیپ با استفاده از فرمول
100× (وزن تر/(وزن خشک-وزن تر)) = محتوای آب اندام هوایی
9- وزن تر اندام هوایی: توزین بوتههای هر کرت بلافاصله پس از برداشت
10- وزن خشک اندام هوایی: توزین بوتههای برداشت شده و خشک شده در هر کرت در آون با دمای 75 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت
11- درصد اسانس برگ: درصد اسانس 100 گرم برگ خشک هر ژنوتیپ به کمک دستگاه تقطیر کلونجر125 و با استفاده از فرمول:
100 × (وزن خشک برگ/وزن اسانس) = درصد اسانس

3-6- مشخصات دستگاه انکوباتور مجهز به لامپLED
دستگاه انکوباتور مجهز به لامپ LED از بخشهای زیر تشکیل شده بود:
3-6-1- بدنه اصلی دستگاه
این بدنه شامل قالب یخچال 12 فوت بودکه جنس داخل آن پلاستوفوم به رنگ سفید و جنس بدنه نیز پلاستوفوم و به رنگ خاکستری بود (شکل 3-1). ارتفاع دستگاه از سطح زمین تا سقف دستگاه 160 سانتیمتر بود. با توجه به اینکه در بخش بررسی عملکرد گیاهان در نور LED نیاز به بررسی 4 نوع رنگ نور قرمز، آبی، ترکیب قرمز+آبی و سفید بود. دو دستگاه با این مشخصات مورد استفاده قرار گرفت. بدین صورت که در انکوباتور اول نور آبی در طبقه بالا و نور قرمز در طبقه پایین و در انکوباتور دوم، ترکیب قرمز و آبی به ترتیب به نسبت 70 به 30 درصد در طبقه بالا و نور سفید در طبقه پایین مورد استفاده قرار گرفت [223].
3-6-2- سیستم تنظیم نور
تعداد 200 عدد لامپ LED سرامیکی در انکوباتور نصب گردیده بود. صفحه کنترل شدت نور تا 20000 لوکس و سیستم نوری دوره نوری نیز توسط شرکت آروین تجهیز طراحی و ساخته شده بود. در هر پنل نوری، 100 عدد لامپ LED یک وات بر روی صفحه آلومینیومی که به عنوان نگهدارنده بود به کار گرفته شده بود.
3-6-3- سیستم تنظیم دما
دما در دامنه صفر تا 40 درجه سانتیگراد توسط یک واحد گرم کننده که در دستگاه نصب شده بود، قابل تنظیم بود. واحد گرم کننده مذکور شامل ترموستات (اتومات)، کنتاکتورهای اتصال، فنر، اهرمها و پیچ تنظیم بود. همچنین سرماسازی در انکوباتور توسط یک کمپرسور با توان 75/0 و مدل دانفوس که شامل لولههای مربوطه از جمله لوله رفت یا فشار گاز، لوله برگشت یا مکش و لوله کور یا لوله مخصوص شارژ گاز و کندانسور بود، فراهم شده بود.
3-6-4- فیلتر هوا
این فیلتر، به منظور حذف آلودگیهای میکروبی اعم از قارچ و باکتری، در جلوی فن تهویه هوا نصب شده بود (شکل 3-1).

3-7- بررسیهای آزمایشگاهی
3-7-1- ارزیابی ژنوتیپهای نعناع از نظر آلودگی به قارچهای میکوریزا قبل از انتقال به مزرعه
ژنوتیپهای مورد مطالعه همراه با ریشه از زیستگاه اصلی آنها در محل جمعآوری نمونه، بیرون آورده شده و به آزمایشگاه فیزیولوژی دانشکده کشاورزی منتقل شدند. رنگآمیزی ریشهها به منظور بررسی وجود همزیستی با قارچهای میکوریزا مطابق با روش فیلیپس و هیمن صورت گرفت [212]. برای این منظور، بعد از شستشو در آب، ریشهها به مدت 24 ساعت در محلول هیدروکسید پتاسیم (KoH) 10 درصد قرار داده شده و مجدداً با آب شستشو گردیدند. سپس مواد به مدت 24 ساعت در اسید لاکتیک 5 درصد و آب اسیدی شده و پس از گذشت مدت زمان لازم مواد به دست آمده در آنیلین بلو126 05/0 درصد که در اسید لاکتیک 80 درصد ریخته شده بود به مدت 24 ساعت قرار گرفت تا رنگ کاملاً درون آنها نفوذ کند. نمونههای به دست آمده در اسید لاکتیک 80 درصد ذخیره شدند. برای تشخیص آلودگی نمونهها به قارچ میکوریزا، 100 سانتی متر از طول ریشه هر ژنوتیپ جدا شده و سپس به قطعاتی به طول 1 سانتیمتر برش داده شدند. 100 قطعه برش خورده روی اسلایدی به ابعاد 10×10 قرار گرفتند (شکل 3-2) و برای جلوگیری از خشک شدن قطعات، گلیسرول:اسید لاکتیک به نسبت 1:5 روی آنها ریخته شد و سپس برای بررسی کلونی قارچ و درصد کلونیزاسیون با استفاده از میکروسکوپ نوری Nikon (مدل Anti) تصاویر به کامپیوتر منتقل و با استفاده از نرم
افزار Photograb-300Z ثبت شدند.
3-7-2- بررسی تأثیر شدت و کیفیت نور بر محتوای اسانس نعناع
3-7-2-1- آزمایش اول
در این مطالعه، ابتدا ریزومهای 3 ژنوتیپ نعناع شامل ژنوتیپهای اصفهان متعلق به گونه M. spicata، قزوین متعلق به گونه M. piperita و همدان متعلق به گونه M. longifolia، با توجه به محتوای اسانس بالا و خصوصیات مورفولوژیکی مناسب، از میان ژنوتیپهای مورد مطالعه در مزرعه، انتخاب گردیدند. ریزومهای هر ژنوتیپ به طور جداگانه در گلدانهای 20×10 سانتیمتر کشت شدند (3 قطعه ریزوم به طول 5 سانتیمتردر هر گلدان) و در داخل 5 انکوباتور حاوی لامپهای LED با طیف نوری قرمز 100 درصد، آبی 100 درصد، مخلوط قرمز و آبی به ترتیب 70 و 30 درصد، سفید و همچنین نور فلورسنت در 3 تکرار قرار گرفتند. آبیاری گلدانها هر روز صورت گرفت. شدت نور اعمال شده در انکوباتورها شامل 300 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه بود. پس از گذشت 60 روز از رشد، اندام هوائی ژنوتیپهای مورد مطالعه از سطح گلدان برداشت شده و صفات مورفولوژیکی آنها شامل ارتفاع ساقه اصلی، طول برگ، عرض برگ، تعداد جوانه گل در هر ساقه، وزن تر اندام هوایی، وزن خشک اندام هوایی و همچنین میزان فتوسنتز و محتوای اسانس آنها بررسی و یادداشت برداری گردید. همچنین خصوصیات فیزیولوژیکی شامل محتوای کلروفیلهای a و b و کاروتنوئیدها و همچنین فعالیت آنزیمهای کاتالاز127، گلوتاتیون ردوکتاز128، اسکوربات پراکسیدار129 و سوپراکسید دیسموتاز130 مورد ارزیابی قرار گرفتند.

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   پایان نامه ارشد رایگان درموردمدیون، ایفای، وفای

3-7-2-2- آزمایش دوم
این آزمایش حاوی دو مرحله جداگانه بود که در دو شدت نوری 150 و 300 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه انجام شد. انتخاب شدتهای نوری مذکور با هدف مطالعه خصوصیات مورفولوژیک و محتوای اسانس گیاه در همزیستی با قارچ میکوریزا تحت شدت نور پایین و بالا بود و انتخاب شدتهای نوری مذکور با توجه به منابع و مطالعات صورت گرفته انجام شد. گلدانهای حاوی ساقه ژنوتیپهای نعناع و گونههای مختلف قارچ (با توجه به روش تلقیح میکوریزا) طی دو مرحله آزمایشی جداگانه داخل 5 انکوباتور حاوی لامپهای LED با طیف نوری قرمز 100 درصد، آبی 100 درصد، مخلوط قرمز و آبی به ترتیب 70 و 30 درصد، سفید و همچنین نور فلورسنت در 3 تکرار قرار گرفتند. آبیاری گلدانها هر روز صورت گرفت و پس از گذشت 60 روز از رشد صفات مورفولوژیک و درصد اسانس در ژنوتیپهای مذکور بررسی گردید.
3-7-3- روش تلقیح میکوریزا در ژنوتیپهای نعناع و ارزیابی صفات مورد بررسی
به منظور تلقیح ژنوتیپهای مورد نظر با قارچ میکوریزا،ابتدا 3 گونه قارچ مایکورایزا شامل Glomus. etunicatum، Glomus. clarum و Glomus. mosseae با خاک کاملاً استریل مخلوط شده و در گلدانهای 30×20 که تا یک سوم با خاک استریل پر شده بودند، به قطر 1 سانتیمتر پاشیده شدند. سپس ساقه ژنوتیپهای مورد نظر شامل پونه همدان متعلق به گونه M. longifolia، طبس متعلق به گونه M. piperita و اهواز متعلق به گونه M. spicata را که از لحاظ عملکرد و خصوصیات رشدی و اسانس نسبت به سایر ژنوتیپها برتر بودند، پس از جداسازی برگها، کاملاًً با آب شستشو گردید و سطح آنها با الکل 50 درصد به مدت 1 دقیقه استریل و سپس 3 بار با آب کاملاً آبکشی شد. پس از آن ساقههای استریل به طول 12 الی 15 سانتیمتر برش داده شده و روی خاک حاوی میکوریزا در هر گلدان به صورت خوابیده قرار گرفتند و لایه نازکی از خاک استریل بر روی لایههای فوق قرار گرفت. گلدانها پس از آبیاری داخل 5 انکوباتور حاوی لامپهای LED و فلورسنت در 3 تکرار قرار گرفتند. تیمارهای شدت نور اعمال شده در انکوباتورها شامل 150 و 300 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه بود. آبیاری گلدانها هر روز صورت گرفت. پس از خروج اولین برگ و ساقه، گلدانها هفتهای 2 بار با محلول هوگلند 50 درصد فسفر، و در سایر روزها با آب معمولی آبیاری شدند [129]. پس از گذشت 120 روز از رشد، اندام رویشی ژنوتیپهای مورد مطالعه از سطح گلدان برداشت شده و صفات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی ذکر شده در آنها ارزیابی شد. میزان آلودگی ریشهها به قارچ میکوریزا و تعیین درصد کلونیزاسیون توسط روش فیلیپس و هیمن [212] بررسی گردید.
3-7-4- اندازهگیری صفات فیزیولوژیک
3-7-4-1- محتوای اسانس برگها
ابتدا برگهای هر ژنوتیپ، پس از برداشت و شستشو در معرض هوای آزاد خشک گردید. برگهای خشک شده با آسیاب برقی خرد شده و به منظور یکنواخت کردن اندازه ذرات، از الک شماره 18 عبور داده شد. سپس میزان 100 گرم از پودر به دست آمده از هر نمونه همراه با 500 میلیگرم آب مقطر در بالن در سمبادهای دستگاه تقطیر کلونجر ریخته شد و دستگاه به مدت 6 ساعت روی هیتر قرارگرفت تا عمل تقطیر در حرارت ملایم (60 تا 70 درجه سانتیگراد) انجام شود. پس از این مدت، حرارت قطع شد و مدت زمان کمی فرصت داده شد تا تمام اسانس حاصله در قسمت مدرج لوله جمع گردد. محتویات لوله رابط به استوانه مدرج 10 میلی لیتری منتقل شد. اسانس به دلیل داشتن وزن سبکتر نسبت به آب در روی آن قرار گرفت. پس از آن اسانس با کمک پیپت پاستور از سطح آب جدا و اندازهگیری شد و سپس با استفاده از ماده شیمیایی سدیم انیدریک آبگیری شد و درون لولههای رابط دربدار کوچک و تیره ریخته شد و جهت تجزیه اسانس، نمونهها به آزمایشگاه دانشگاه شهید بهشتی تهران منتقل شد.
3-7-4-2- مواد موثره اسانس
اسانس استخراج شده از ژنوتیپها توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی131 واقع در آزمایشگاه دانشکده داروسازی دانشگاه شهید بهشتی آنالیز شد. دستگاه کروماتوگراف گازی از نوع 6890 Agilent با ستون به طول
30 متر، قطر داخلی 25/0 میلیمتر و ضخامت لایه 25/0 میکرومتر از نوع MS5-HP بود.
برنامهریزی دمایی ستون به این نحو تنظیم گردید: دمای ابتدائی آون 50 درجه سانتیگراد و توقف در این دما به مدت 5 دقیقه، گرادیان حرارتی 3 درجه سانتیگراد در هر دقیقه، افزایش دما تا 240 درجه سانتیگراد با سرعت 15 درجه در هر دقیقه، افزایش دما تا 300 درجه سانتیگراد و سه دقیقه توقف در دمای مذکور. دمای اتاقک تزریق 290 درجه سانتیگراد بود و از گاز هلیوم به عنوان گاز حامل با سرعت جریان132 8/0 میلیلیتر در دقیقه استفاده گردید.
طیف نگار جرمی مورد استفاده مدل 5973 Agilent با ولتاژ یونیزاسیون 70 الکترون ولت، روش یونیزاسیون EI و دمای منبع یونیزاسیون 220 درجه سانتیگراد بود. شناسایی طیفها و در نهایت اجزاء موجود در اسانس به کمک

دسته‌ها: پایان نامه ها

دیدگاهتان را بنویسید